Effizienter und präziser Erbgut verändern

Eine weiterentwickelte Form der Genom-Editierung ermöglicht es, Erbgut noch präziser und auf mehr Wegen als bisher zu verändern und zu korrigieren. Die neue Methode soll laut ihrer Entwickler bis zu 89 Prozent aller bekannten menschlichen Erbkrankheiten korrigieren können. Darüber hinaus eröffnet sie zahlreiche Möglichkeiten der Erbgutbearbeitung für die Grundlagenforschung und die Grüne Gentechnik, um zum Beispiel resistente Pflanzen zu erzeugen.

Die von US-amerikanischen Forschern des „Broad Institute“ in Cambridge entwickelte „Prime Editing“ (PE) Methode baut auf der Idee der Genschere CRISPR/Cas9 auf. Der Komplex aus zwei modifizierten Proteinen und einer spezifischen RNA-Vorlage kann präzise an einer bestimmten Stelle im Erbgut einen einzelnen DNA-Baustein (Base) austauschen, einfügen (Insertion), löschen (Deletion) oder mit Kombinationen daraus Veränderungen erzeugen. Im Gegensatz zu CRISPR/Cas9 verändert der PE-Komplex das Erbgut, ohne dabei beide DNA-Stränge zu schneiden, deren Reparatur häufig zu unkontrollierten Fehlern führt. Gleichzeitig ist PE effizienter als die bisherigen Genom-Editierungsmethoden und führt zu weniger unerwünschten Nebeneffekten, wie Veränderungen an Nicht-Zielorten (off-target Effekte).

In vier verschiedenen menschlichen Zelllinien sowie in Nervenzellen von Mäusen führten die Wissenschaftler mit PE über 175 Veränderungen durch, zu denen gezielte Insertionen, Deletionen und alle zwölf Formen des Basenaustausches zählten. Darüber hinaus korrigierten sie die primären genetischen Ursachen der Sichelzellanämie und der Tay-Sachs-Krankheit in den Zellen effizient und mit nur wenigen Nebeneffekten. Ihre Ergebnisse veröffentlichten die Forscher in „Nature“ (siehe Primärquelle).

 

• Prof. Dr. Holger Puchta, Geschäftsführender Direktor des Botanischen Instituts und Inhaber des Lehrstuhls Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen, Karlsruher Institut für Technologie (KIT)

 

• Dr. Frank Hartung, Wissenschaftler am Institut für die Sicherheit der biotechnologischer Verfahren bei Pflanzen, Julius Kühn-Institut (JKI), Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen, Berlin

 

• Prof. Dr. Jens Boch, Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover

 

Statements von Experten aus dem Bereich der Roten Gentechnologie (Entwicklung therapeutischer und diagnostischer Verfahren)

 

• Dr. Ralf Kühn, Leiter der Forschungsgruppe iPS-zellbasierte Krankheitsmodellierung, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC), Berlin-Buch

 

• Jan Korbel, Forschungsgruppenleiter, Genome Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory (EMBL)

 

• Prof. Dr. Dirk Heckl, Professor für Experimentelle Pädiatrie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

 

Statements von Experten aus dem Bereich der Grünen Gentechnologie (Pflanzenzüchtung, Pflanzengenetik)

Prof. Dr. Holger Puchta

Geschäftsführender Direktor des Botanischen Instituts und Inhaber des Lehrstuhls Molekularbiologie und Biochemie der Pflanzen, Karlsruher Institut für Technologie (KIT)

„Als Grundlagenforscher bin ich vor allem von der intellektuellen Brillanz, mit der Technologie entwickelt wurde, sehr beeindruckt. Basierend auf dem CRISPR/Cas System wurden hier mehrere unterschiedliche Arten der DNA-Veränderungen auf eine sehr clevere Weise kombiniert, um gezielte Mutationen ins Genom einzubringen. Selbstverständlich muss sich noch zeigen, wie breit die Technologie angewandt werden kann, aber sie ist sicherlich ein wichtiger Beitrag zur Verbesserung der bisherigen Techniken zur Genom-Editierung. Wir sollten auf der anderen Seite die Technik aber auch nicht überbewerten, da im Prinzip viele gezielte Veränderungen mit anderen bisher etablierten CRISPR/Cas-Anwendungen bereits jetzt erreichbar sind.“

„Gerade für Pflanzen scheint die Technologie besonders interessant zu sein. Wir arbeiten seit langem daran, genau geplante Veränderungen ins Genom einzubringen. Dies ist im Gegensatz zum einfachen Ausschalten von Genen immer noch sehr ineffizient. Die Technik könnte also tatsächlich helfen, leichter krankheitsresistente Pflanzen oder glutenfreie Pflanzenprodukte zu erhalten. Das muss aber selbstverständlich erst getestet werden.“

„Das Risiko hängt immer von der Anwendung ab. In der Medizin ist es sehr wichtig, beim Einsatz von molekularen Scheren jegliche Art von zusätzlichen, unspezifischen Genomveränderungen bei der Anwendung auszuschließen. Hier scheint mir die Technologie wirklich vielversprechend zu sein. Es sind aber sicherlich noch weitere Experimente notwendig, bevor man ein abschließendes Urteil fällen kann. Bei Pflanzen spielen solche Fragestellungen aber eher eine untergeordnete Rolle, da die Züchtung seit 70 Jahren bei der klassischen Mutagenese tausende von ungerichteten Genomveränderungen in Kauf nimmt.“

Dr. Frank Hartung

Wissenschaftler am Institut für die Sicherheit der biotechnologischer Verfahren bei Pflanzen, Julius Kühn-Institut (JKI), Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen, Berlin

„Prime Editing (PE) stellt eine deutliche Verbesserung der gezielten Sequenzveränderung dar. Die Veränderung einer Sequenz in eine gewünschte neue Basenabfolge ist mit Hilfe der Homologie gerichteten Rekombination (HDR) bisher nur in wenigen Zelltypen effizient machbar. PE erreicht eine gleiche und oft bessere Effizienz als HDR und ist auch in anderen Zelltypen einsetzbar. Ein weiterer Vorteil des PE ist, dass die Methode keinen Doppelstrangbruch der DNA erzeugt und damit weniger Nebeneffekte im Genom auslöst. Die einzelnen Komponenten des PE sind bekannt und wurden schon eingesetzt. Die Kombination in einem Ansatz ist das eigentlich Neue, was die oben erwähnten Vorteile für die Forschung und Anwendung bringt.“

„Im Prinzip kann PE genauso auch in Pflanzen eingesetzt werden, muss jedoch wahrscheinlich erst an das System Pflanze angepasst werden, zum Beispiel bezüglich der Effizienz einzelner Komponenten. Nickasen (Enzyme, die einen Strang der DNA-Doppelhelix an einer spezifischen Stelle schneiden; Anm. d. Red.) wurden schon erfolgreich verwendet. Meines Wissens nach hat noch keiner die Fusion von Cas9 mit einer reversen Transkriptase in Pflanzen getestet. Neue Möglichkeiten ergeben sich nicht direkt, die bestehenden Möglichkeiten mittels HDR gezielte Veränderungen vorzunehmen werden allerdings durch PE vermutlich verbessert. Der Vorteil von reduzierten Nebeneffekten ist im Pflanzenbereich nicht relevant, da die Nebeneffekte durch zum Beispiel Zellkulturen erheblich größer sind als die durch das PE.“

„Die Frage nach Risiken, die auch durch PE verbleiben, lässt sich schwer beantworten, da die Gewichtung von Risiken bei Mensch/Tier und Pflanze meines Erachtens unterschiedlich sind. PE kann bei menschlichen Anwendungen das Risiko unerwünschte Nebeneffekte bei der Behandlung zu erhalten deutlich mindern. Dies geht aber auch durch andere verbesserte Cas9-Enzyme. Neu an dem System PE ist der effizientere und gezielte Austausch einer Sequenz in verschiedenen Zelltypen. Dies kann das Spektrum der Anwendungen deutlich erweitern und ist kombiniert mit den geringeren Nebeneffekten eine deutliche Risikominderung.“

„Bei Pflanzen spielt dies keine so große Rolle, da die Nebeneffekte generell im Rahmen dessen liegen, was natürlicherweise an Mutationen auftritt oder durch zum Beispiel Zellkultur erhöht wird. Weiterhin fällt bei einer Pflanze das Risiko nicht auf sie selbst zurück, sondern darauf, ob sie durch den Nebeneffekt eine schädliche Wirkung auf Mensch/Tier oder die Umwelt entfalten kann. Dies ist extrem unwahrscheinlich, da solche Pflanzen auch natürlich entstehen und solche, die nicht natürlich entstehen könnten, einer sehr genauen Risikountersuchung unterzogen werden.“

„Zusammenfassend lässt sich sagen, das PE einen entscheidenden Fortschritt auf dem Weg zur gezielten, möglichst nebeneffektarmen Sequenzveränderung darstellt.“

Prof. Dr. Jens Boch

Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover

Zum wissenschaftlichen Hintergrund:„Genome Editing hat es erstmals ermöglicht, das Erbgut höherer Lebewesen – einschließlich Pflanzen, Tiere und Menschen – gezielt zu verändern. Die typische Anwendung des Genome Editing führt zu einer kleinen Veränderung an einer gewünschten Stelle im Erbgut, aber die genaue Veränderung (Mutation) ist weitgehend zufällig. Falls gleichzeitig zum CRISPR/Cas-Werkzeug auch eine Kopiervorlage (Englisch: template) in der Zelle vorhanden ist, oder in die Zelle eingebracht wird, so kann es auch zu einer präzisen Veränderung kommen – exakt so, wie die Vorlage entworfen wurde. Diese zweite Variante der Reparatur erfolgt sehr viel seltener, sodass die Effizienz dieser Art des Genome Editing sehr gering ist. Da es viel besser wäre, exakte Veränderungen zu erlangen, ist es derzeit eines der Top-Ziele der aktuellen Genom-Editing-Forschung die Effizienz dieser Methode zu verbessern.“

„Eine effiziente Variante gibt es bereits. Nutzt man statt des normalen CRISPR/Cas9-Systems einen sogenannten ‚Baseneditor‘ (engl.: base editor), dann können in einem Bereich gezielt die grundlegenden Bausteine des Erbguts direkt verändert werden, ohne dass weitere zufällige Veränderungen entstehen. Allerdings können hiermit nicht alle Veränderungen, die bei Erbkrankheiten eine Rolle spielen, behoben werden – Insertionen oder Deletionen sind nicht möglich. Die Methode wurde für zwei verschiedene CRISPR/Cas-Baseneditoren – ebenso wie die neue Methode – im Labor von David R. Liu entwickelt [1][2].“

Zur aktuellen Studie:„Die Arbeit von Anzalone et al. ist eine wesentliche Erweiterung der derzeitigen Möglichkeiten des Genom-Editings. Die neue Methode ermöglicht präzise Änderungen des Erbguts mit hoher Effizienz, von denen viele bisher so nicht möglich waren. Die gezielte Korrektur von Fehlern im Erbgut ist der Schlüssel zur Therapie von Erbkrankheiten beim Menschen. Im Gegensatz zu derzeitigen Möglichkeiten, eine präzise Veränderung im Erbgut zu schaffen, benötigt die neue Methode keine DNA-Vorlage, sondern nutzt eine RNA-Vorlage, die im Prinzip sowieso für die Funktion des CRISPR/Cas-Systems nötig ist. Hiermit sinkt das Risiko, dass sich eine zusätzliche Reparaturvorlage an ungewollten Stellen ins Erbgut einfügt. Die neue Methode ist ein überaus nützlicher Mittelweg der bisherigen Möglichkeiten. Sie ist sehr effizient und erlaubt viele neue Möglichkeiten, führt dabei jedoch auch zu ungeplanten Änderungen, sodass hier noch Optimierungen wünschenswert sind.“

„Für die Züchtung landwirtschaftlich genutzter Pflanzen ist die neue Methode besonders vielversprechend. Dabei ist es sehr viel schwieriger für eine präzise Veränderung durch Genome Editing eine Reparaturvorlage in die Zelle einzuführen und ungeplante Änderungen können in der Züchtung auf einfache Weise aussortiert werden. Auch wenn das in dieser Veröffentlichung nicht gezeigt wurde, wird sich das neue System mit Sicherheit ebenso in Pflanzen anwenden lassen. Die Methode ermöglicht es nun, sehr rasch präzise Änderungen für nützliche Eigenschaften in wichtige Kultursorten einzuführen. Dieses wird die moderne Züchtung sehr beschleunigen. In Europa fällt auch diese neue Methode unter das Gentechnikgesetz und wird daher für den europäischen Markt nicht zur Anwendung kommen.“

„Auch die neue Technik führt zu ungeplanten Veränderungen und zwar in nicht unerheblichem Umfang. Solche Veränderungen können grundsätzlich ein Risiko darstellen, auch wenn es positiv ist, dass das Risiko im Vergleich zum derzeitigen System auf gewisse Weise geringer geworden ist, da die ungewollten Veränderungen hauptsächlich am Einsatzort im Erbgut auftreten und seltener als bisher an anderen Orten. Für die Anwendung im medizinischen Bereich ist weitere Forschung nötig und es müsste eine sorgfältige Risiko-Nutzen-Abwägung vorgenommen werden. Für sehr schwere Erkrankungen rücken neue Wege der Heilung hiermit aber deutlich näher.“

Statements von Experten aus dem Bereich der Roten Gentechnologie (Entwicklung therapeutischer und diagnostischer Verfahren)

Dr. Ralf Kühn

Leiter der Forschungsgruppe iPS-zellbasierte Krankheitsmodellierung, Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC), Berlin-Buch

„Aus meiner Sicht stellt das Prime editing eine deutliche Verbesserung gegenüber bisherigen Geneditierungstechniken zur Erzeugung oder Korrektur präziser Sequenzveränderungen im Größenbereich von 1 bis 30 Basenpaaren dar. Diese bestehen darin, dass kein DNA-Doppelstrangbruch, sondern nur ein Einzelstrangbruch – ein sogenannter ‚nick‘ – erzeugt wird. Dadurch werden wesentlich weniger unerwünschte Nebenprodukte an der Zielsequenz als auch an anderen genomischen Bereichen (off target sites) erzeugt. Zweitens wird kein DNA-Donormolekül als Reparaturvorlage für die homologe Rekombination benötigt, sondern die neue Sequenz als RNA an die guide RNA angehängt und diese durch eine mit Cas9 fusionierten reversen Transkriptase in DNA umgeschrieben. Insofern ist Prime Editing sowohl der homologen Rekombination überlegen (kein Doppelstrangbruch, kein DNA-Donor) als auch den Baseneditoren, die eine starke Beschränkung bei der Addressierung vieler Zielsequenzen haben. Zur Erzeugung anderer Editierungsprodukte, wie gezielten größeren Deletionen oder Sequenzinsertionen (über 30 Basenpaare), ist Prime Editing dagegen nicht geeignet.“

„Prime Editing stellt vom Konzept her die bisher beste Möglichkeit dar einen Großteil der kleineren (unter 30 Basenpaare) Mutationen in menschlichen Genen zu korrigieren. Die bisherigen Ergebnisse wurden aber nur in humanen Tumorzelllinien erzielt, die sich ständig teilen. Zur Korrektur von Mutationen in vivo müsste die Methode aber auch effizient in ruhenden, somatischen Zellen funktionieren. Wäre dies der Fall – was bei Anzalone et al. aber (noch) nicht gezeigt ist, dann würde ich es als ‚Meilenstein‘ bezeichnen. Zur Zeit hat es sicher Potenzial für einen zukünftigen Meilenstein, da Anzalone et al. auch bereits sieben Prozent Editierung in primären Mausneuronen erzielt haben. Um das Potential der Methode in ruhenden Zellen beurteilen zu können, werden aber weitere Versuche in primären humanen Zellen benötigt.“

„Die Risiken sind im Prinzip die gleichen wie bei der bisherigen Verwendung von Cas9 in der Erzeugung unerwünschter Nebenprodukte, nur sind diese in der Häufigkeit deutlich reduziert. Unerwünschte Nebenprodukte sind Deletionen in der Zielsequenz und anderen genomischen Loci sowie Translokationen, die von Anzalone et al. nocht nicht untersucht wurden. Das Risiko in der Anwendung zur Gentherapie besteht dabei in der möglichen Erzeugung einer genetischen Konfiguration, die zur Tumorbildung beiträgt. Um dieses abzuschätzen, werden Untersuchungen von editierten humanen Zellen in Tiermodellen wie immundefizienten Mausstämmen nötig sein.“

Dr. Jan Korbel

Forschungsgruppenleiter, Genome Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory (EMBL)

„Bei der sogenannten Prime-Editierung handelt es sich um eine intelligente Weiterentwicklung der CRISPR/Cas9-Technologie. Das Prime Editing führt anders als die vorher bekannte ‚Genschere‘ CRISPR/Cas9 durch den gezielten Einsatz eines bestimmten Enzyms – der sogenannten reversen Transkriptase – keine Zerschneidung des Erbgutes durch. Die Forscher haben gezeigt, dass das Prime Editing deshalb einen geringeren Anteil an unerwünschten Mutationen erzeugt als die herkömmliche CRISPR/Cas9-Genschere. Dies kann für zukünftige Anwendungen in der Medizin sehr wichtig sein.“

„So wie die bereits bekannte CRISPR/Cas9-Technologie ist auch das Prime Editing nicht frei von Risiken – das heißt, auch sie produziert unerwünschte Mutationen als Nebenprodukte der Erbgut-Editierung. Dies schließt auch Mutationen ein, die derzeit mit gängigen Verfahren nur schwer messbar sind, wie zum Beispiel größere Umlagerungen von Chromosomen. Derartige Nebenprodukte sollten in Zukunft ausgeschlossen werden können, bevor die Technologie sicher in der Medizin angewendet werden kann. Soweit sind wir derzeit aber noch nicht.“

Prof. Dr. Dirk Heckl

Professor für Experimentelle Pädiatrie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

„Die technologische Studie von Anzalone und Kollegen beschreibt eine neue Methode der Genomeditierung basierend auf dem Cas9-Enzym in einer Fusion mit einer retroviralen reversen Transkriptase.“

„Auf Grund der Verwendung einer enzymatisch partiell inaktivierten Cas9 – einer so genannten Nickase, welche nur einen Einzelstrangbruch erzeugt – wird das große Risiko der DNA-Doppelstrangbrüche an off-target Stellen unterbunden. Anstelle einer Editierung durch einen Doppelstrangbruch, wird bei der Methode von Anzalone et al. eine verlängerte guide RNA verwendet (pegRNA genannt). Die Verlängerung der gRNA entspricht einem kurzen Bereich der komplementären Sequenz des Ziels und kann diesen binden. Im Folgenden wird der nicht komplementäre Teil durch die reverse Transkriptase vom RNA Level auf das DNA Level ‚übersetzt‘. Damit dient die pegRNA als Vorlage – Primer – für die reverse Transkriptase und folglich wird die Methode als Prime Editing beschrieben.“

„Die Methode wird sehr detailliert dargestellt und ist nach den Autoren in der Editierung einer einzelnen Base ähnlich effizient wie das Editieren mit der vollaktiven Cas9, wobei ein Großteil der ungewünschten off-target Aktivität unterbunden wird. Im Vergleich zu sogenannten Baseneditoren, einer weiteren CRISPR-Technik ohne Doppelstrangbruch, wird zudem höhere Spezifität erreicht. Darüber hinaus sind zudem größere Editierungen (mehr als eine Base) möglich, welche ebenfalls mit erstaunlicher Effizienz eingefügt werden.“

„Mit diesen Eigenschaften stellt das Prime Editing einen sehr vielversprechenden Ansatz für die Gentherapie dar. Die stark reduzierte off-target Aktivität in Verbindung mit der hoch-spezifischen Änderung der Zielregion und mit der Kapazität mehrere Basen zu verändern, ist sehr vielversprechend. Die gezeigte Effizienz ist erstaunlich und nach unabhängiger Validierung ein hoch attraktiver Ansatz, der einen Meilenstein auf dem Weg zur therapeutischen Anwendung der CRISPR-Technologie in gentherapeutischen Ansätzen darstellen könnte.“

„Offene Fragen bei der Methode der Autoren bleibt der Effekt einer reversen Transkriptase in der humanen Zelle: Kommt es zur RNA-DNA Konversion von endogenen Transkripten, wodurch diese an unbekannten Stellen im Genom integriert werden könnten? Wie wirkt sich die virale reverse Transkriptase auf die Immunogenität des Systems aus? In welchen Dosen ist das System wirksam?“

„Die Autoren sind hier jedoch offen und unterstreichen, dass weiterführende Studien notwendig sein werden, bis es zu einem Einsatz kommen kann. Dies ändert nichts an der Innovationskraft des Systems und es ist davon auszugehen, dass Folgestudien nicht lange auf sich warten lassen werden.“

Angaben zu möglichen Interessenkonflikten

Dr. Frank Hartung: „Interessenkonflikte habe ich keine.“

Dr. Ralf Kühn: „Interessenkonflikte habe ich keine.“

Prof. Dr. Dirk Heckl: „Interessenkonflikt besteht nicht.“

Alle anderen: Keine angegeben.

Primärquelle

Anzalone AV et al. (2019): Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. DOI: 10.1038/s41586-019-1711-4.

Literaturstellen, die von den Experten zitiert wurden

[1] Komor AC et al. (2016): Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature: 19;533(7603):420-4. DOI: 10.1038/nature17946.

[2] Gaudelli NM et al. (2017): Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature: 23;551(7681):464-471. DOI: 10.1038/nature24644.

Weitere Recherchequellen

Science Media Center Germany (2016): CRISPR-Cas9 als revolutionäre Methode des Genome Editing. Fact Sheet. Stand: 26.04.2016.